• Nikon A1 MP+
  • A1 MP+
  • A1R MP+
  • NDD
  • GaAsP NDD
  • Спектральный детектор
  • Галерея

Мультифотонный конфокальный микроскоп Nikon A1 MP+, A1R MP+

Лазерные конфокальные микроскопы A1MP+/A1R MP+ обеспечивают быстрое и четкое получение изображений глубоких слоев ткани живых организмов, расширяя тем самым границы традиционных исследовательских методов применяемых в биологии.

Скорость получения изображений до 420 кадров/сек (512х32 пикселей) вместе с мультифотонным формированием изображений с использованием высокоэффективной оптики и резонансного сканера A1R MP+.

Получение изображений глубоких слоев ткани образца при помощи детекторов NDD, размещенных рядом с задней апертурой объектива.
Сверхчувствительные арсенид-фосфид галлиевые (GaAsP) NDD-детекторы позволяют получить изображений мозга мыши in vivo на глубине свыше 1,4 мм.

Функция автоматической юстировки лазера предусматривает быструю корректировку смещения инфракрасного лазерного луча после изменения длины волны многофотонного возбуждения.

Инфракрасный лазер подключается к микроскопу при помощи компактного оптического блока, содержащего акустооптический модулятор и выполняющего функции автоматической юстировкой лазера.

Совместимость с прямым и инвертированным микроскопами.

Обеспечивает получение оптимальных мультифотонных изображений при исследованиях мозга, других нейробиологических применений и получение in vivo изображений живых организмов.

Качество изображения

Эффективность флуоресценции увеличена на 30%, также увеличено отношение сигнал/шум.

В серии микроскопов А1 MP+ технология малого угла падения лучей применена впервые на дихроичных зеркалах, благодаря чему увеличен уровень флуоресценции на 30 %.

Стандартный метод с 45° углом падения Метод малого угла падения

Характеристики отражения-пропускания лучей сильно зависят от поляризации

Характеристики отражения-пропускания лучей имеют меньшую зависимость от поляризации

Вместо квадратного точечного отверстия с плавным изменением размера впервые используется точечная диафрагма шестигранной формы. Благодаря этому при сохранении конфокальности достигается более высокая яркость, почти эквивалентная идеально круглому точечному отверстию (на 30%больше света!).

64 % площади круга 83 % площади круга

Для увеличения эффективности и предотвращения потери сигнала при обработке пиксельных данных системой оцифровки сигнала и при сбросе, в схеме процесса обработки изображений была реализована оригинальная разработка компании Nikon – технология двойной интегрированной обработки сигнала (DISP). Сигнал отслеживается в течение всего времени приема информации с пикселя, благодаря чему достигается чрезвычайно высокое соотношение сигнал/шум. Два интегратора работают параллельно во время считывания оптической информации, что позволяет избежать пропусков.

Принцип мультифотонного возбуждения

Когда одна флуоресцентная молекула поглощает одновременно два фотона (двухфотонное возбуждение), эффективность возбуждения пропорциональна квадрату интенсивности возбуждающего излучения. Чтобы добиться мультифотонного возбуждения, используется импульсное излучение с высокой плотностью фотонов или интенсивности. Так как лазерное излучение представляет собой очень короткие (фемтосекунды) импульсы и достигает фокальной точки после прохождения через объектив, вероятность одновременного поглощения двух фотонов становится достаточно высокой.
В случае двухфотонного возбуждения эффективность возбуждения снижается обратно пропорционально четвертой степени расстояния от фокальной плоскости. В результате только флуоресцентные молекулы расположенные в пределах объема ограниченного дифракционным пределом объектива возбуждаются и могут флуоресцировать. Этот принцип позволяет использовать NDD детекторы где для достижения конфокальных результатов не требуется точечная диафрагма.
При прохождении через образец инфракрасное излучение поглощается и рассеивается меньше, чем видимые длины волн, поэтому возбуждающее излучение может легче проникать в глубокие слои ткани.
Так как двухфотонное возбуждение сильно ограничено дифракционным пределом фокального объема, исключается необходимость использования конфокальной точечной диафрагмы для устранения попадания флуоресцентного излучения из плоскостей вне фокуса на детектор. Таким образом, обеспечивается минимизация фотоповреждений образцов и создаются условия для регистрации флуоресцентного излучения от живых образцов. При использовании NDD детектора и системы предварительной компенсации дисперсии групповых скоростей, встроенной в мультифотонный лазер, можно получать флуоресцентные изображения более глубоких слоев ткани образцов, используя стандартный конфокальный метод.

Фемтосекундные импульсные лазеры

Когда импульсное излучение, длительностью около 100 фемтосекунд, проходит через оптику микроскопа (например, объектив), длительность импульса увеличивается из-за дисперсии групповых скоростей (изменение скорости при прохождении через стеклянную подложку), вызывая снижение пиковой мощности.
Чтобы предотвратить снижение пиковой мощности импульса, в фемтосекундных импульсных лазерах для мультифотонной микроскопии компании Nikon предусмотрены механизмы предварительной компенсации дисперсии групповых скоростей, которые восстанавливают исходную длительность импульса в образце. Механизмы предварительной компенсации были оптимизированы для оптической системы Nikon. Это позволяет получать яркие флуоресцентные изображения глубоких слоев ткани образцов при минимальной мощности лазера.

Программное обеспечение NIS-Elements C

Обычные операции, выполняемые конфокальными микроскопами Nikon

  • Все необходимые операции по регистрации изображений отображаются в одном окне.
  • Лазеры и детекторы, регистрирующие флуоресценцию от возбуждения лазером видимого диапазона, легко переключаются путем выбора флуоресцентного зонда.
  • Переключение между высокоскоростным резонансным сканером и гальвано-сканером (не резонансным) для высокого разрешениея осуществляется одним нажатием кнопки.
  • Предусмотрена одновременная фотоактивация и высокоскоростное получение изображений при помощи возбуждения лазером видимого диапазона.

Функции для получения мультифотонных изображений высокого качества

  • Функция автоматической юстировки лазера
    В случае изменения длины волны возбуждения юстировка ИК лазера осуществляется одним нажатием кнопки.
  • Функция контроля интенсивности Z
    Пользователи могут выбрать мощность лазера и коэффициент усиления ФЭУ при получении Z-стэков при помощи функции контроля интенсивности Z. Таким образом, даже при формировании изображений плотных и толстых образцов, интенсивность излучения будет оставаться постоянной.
  • Функция разделения каналов
    Функция разделения каналов компании Nikon позволяет регистрировать излучение одновременно от нескольких фотоумножителей NDD детекторов, использую одну длину волны возбуждения ИК лазера NDD и разделять перекрывающиеся спектры, предотвращать наложение спектров.
  • Функция запуска
    Микроскоп A1 MP+/A1R MP+ и программное обеспечение NIS Elements C поддерживают запуск приложений предназначенных для синхронизации интервала и времени сканирования с регистрацией электрофизиологических данных, а также для внешнего запуска сканирования.

Объективы Nikon с высокой числовой апертурой идеально подходят для получения мультифотонных изображений

Объективы с высокой числовой апертурой были разработаны для коррекции хроматической аберрации во всем диапазоне длин волны от ультрафиолетового до инфракрасного. Светопропускание повышается благодаря использованию эксклюзивной технологии Nikon Nano Crystal Coat.
В частности, линзы погружного объектива CFI Апохромат 25xW MP обеспечивают высокую числовую апертуру равную 1,10, при этом сохраняя рабочее расстояние, равное 2,0 мм. Также предусмотрено кольцо, которое корректирует хроматическую аберрацию в зависимости от глубины образца. Конструкция объектива обеспечивает угол подвода пипетки манипулятора, равный 33°, делая его идеальным для получения мультифотонных изображений глубоких тканей и для применения в физиологических исследованиях.

Nano Crystal Coat – это эксклюзивная технология покрытия линз компании Nikon, в которой применяется несколько слоев наночастиц со сверхнизким показателем преломления, созданная при разработке промышленного оборудования производящего полупроводники. Структура покрытия Nano Crystal Coat значительно снижает отражение от внешней поверхности линзы и увеличивает пропускание во всем диапазоне.

Объективы:

CFI75 Apochromat 25xW MP NA 1.10, WD 2.00 мм
CFI Apochromat 40xWI λS NA 1.25, W.D. 0.18 мм
CFI Apochromat LWD 40xWI λS NA 1.15, W.D. 0.60 мм
CFI Plan Apochromat IR 60xWI NA 1.27, W.D. 0.17 мм

Автоматическая юстировка лазера при изменении длины волны при мультифотонном возбуждении

При изменении длины волны лазера или предварительной компенсации дисперсии групповой скорости положение лазерного луча на задней апертуре объектива может также изменяться, что приводит к неравномерной яркости изображений или к небольшому несовпадению путей инфракрасного и видимого лазерного излучения.
Юстировка лазерного луча обычно является сложной задачей. Благодаря функции автоматической юстировки лазера в A1 MP+ компании Nikon, предусмотренной в оптическом блоке для мультифотонного возбуждения, юстировка ИК лазера выполняется автоматически одним нажатием кнопки в NIS Elements C.