Конфокальный микроскоп Nikon A1+, A1R+

Гальванический (нерезонансный) сканер A1+/A1R+ обеспечивает получение изображений с высоким разрешением (до 4096 х 4096 пикселей). Помимо этого, благодаря новейшим системам привода сканера и отбора образцов, а также уникальной технологии коррекции изображений Nikon, также возможно высокоскоростное получение изображений со скоростью 10 к/с (512 х 512 пикселей).

1D сканирование: 5200 строк в секунду
2D сканирование: 130 к/с (512 х 32 пикселя)
Полнокадровое сканирование: 10 к/с (512 х 512 пикселей)

Стандартный четырехканальный детектор избавляет от необходимости приобретения дополнительного флуоресцентного детектора и позволяет с легкостью получать изображения образца, помеченного четырьмя зондами.

Серия Z-проекций XYZ изображений клетки LLC-PK1, экспреcсирующей EGFP-альфа-тубулин (зеленый) и Histone H2B-mCherry (красный). Изображение фиксировалось каждые 2 минуты с помощью гальванического сканера.

Белок Kaede необратимо изменяет цвет флуоресценции с зеленого на красный из-за спектральной конверсии при воздействии на него излучения от ультрафиолетовой до фиолетовой области спектра. В момент фиксации изображения клетки HeLa, экспрессирующей Kaede с зеленой и красной флуоресценцией, при помощи лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм, в качестве возбуждающих, для фото-конверсии белок Kaede в изучаемой области непрерывно активировался лазером с длиной волны 405 нм. На фотографиях представлена дисперсия красной флуоресценции Kaede, вызываемой фото-конверсией. Длина волны активирующего лазера: 405 нм, длина волны лазера, фиксирующего изображение: 488 нм / 561 нм, размер изображения 512 х 512 пикселей, скорость захвата 1 к/с (при помощи гальванического сканера).

Фотоактивируемый белок Phamret - это гибридный белок состоящий из двух частей: белка CFP и белка PA-GFP. Когда белок PA-GFP активируются при помощи фиолетово-ультрафиолетового излучения, его светло-голубая флуоресценция в результате межмолекулярного резонансного переноса энергии от CFP к PA-GFP изменяется на зеленую.

Во время получения изображения клеток HeLa, экспрессирующих Phamret посредством голубой и зеленой флуоресценции, при помощи лазера с длиной волны 457 нм, часть PA-GFP в изучаемой области непрерывно возбуждается лазером с длиной волны 405 нм. Активированная часть, наблюдаемая в области голубой флуоресценции (показана на изображении оттенками серого) испускает зеленую флуоресценцию (на изображениях показана красным). Реакция, на которую указывает зеленое свечение, является реакцией дисперсии Phamret (на изображениях она показана красным).

A1R+ представляет собой гибридную сканирующую головку, оснащенную как гальваническим, так и резонансным сканером, со сверхвысокой резонансной частотой 7,8 КГц. Благодаря такой комбинации двух сканеров модель A1R+ обеспечивает сверхбыстрое получение изображений, при котором возможна одновременная фотоактивация. Она обеспечивает высокоскоростное получение изображений и фотоактивацию при 420 к/с (512 х 32 пикселя), что является самым быстрым результатом в мире.

1D Сканирование: 15600 строк в секунду (с/с)
2D Сканирование: 420 к/с (512 х 32 пикселя)
Полнокадровое сканирование: 30 к/с (512 х 512 пикселей)

Резонансный сканер (зеленый оптический путь) используется для получения изображений с высокой скоростью до 420 к/с (с разрешением 512 х 512 пикселей). Во время одновременной фотоактивации и получения изображений резонансный сканер используется для захвата изображения.

Гальванический сканер (синий оптический путь) используется для получения высококачественных изображений с высоким разрешением до 4096 х 4096 пикселей. Также возможно высокоскоростное получение изображений с частотой кадров до 10 к/с (с разрешением 512 х 512 пикселей). Во время одновременной фотоактивации и получения изображений гальванический сканер используется для фотостимуляции.

Гибридный сканер - это механизм, который позволяет гибко переключаться между двумя сканерами (резонансный и гальванический), либо использовать их одновременно с помощью высокоскоростного гипер-селектора. Может быть введено излучение одновременно от 7 лазеров (максимум 9 длин волн).

В хороших физиологических условиях возможно получение изображений динамики флуоресцентно-окрашенных агентов и витальных субстанций в живых организмах.

Визуализированное со скоростью 120 к/с (8 мс/к) движение Tetramethyl Rhodamine и Acridine Orange по кровеносным сосудам мыши. Красный – кровеносный сосуд. Зеленый – ядро.

Для высокоскоростного получения изображения с помощью резонансного сканера используется оригинальная методика определения положения сканирующего зеркала компании Nikon. Постоянные тактовые импульсы генерируются оптическим способом, что обеспечивает отсутствие как эффекта мерцания, так и искажений даже на самой высокой скорости сканирования.

Волоконно-оптическая система передачи данных может транслировать данные с максимальной скоростью 4 Гбит в секунду. Это позволяет передавать изображения (512 х 512 пикселей, 16 бит) в пяти режимах со скоростью 30 кадров в секунду.

Резонансные сканеры не страдают от перегрева мотора при высокоскоростном получении изображений. Таким образом, отсутствует необходимость в сокращении поля обзора сканированного изображения для предотвращения перегрева. Это обеспечивает большее поле обзора, чем у гальванического сканера.

PA-GFP необратимо переходит из темного состояния в светлое, а его спектр поглощения смещается в область 488 нм при облучении излучением с длиной волны 405 нм.

Изучаемая область в HeLa клетке была фотоактивирована лазером с длиной волны 405 нм в течение 1 секунды, изображение фиксировалось лазером 488 нм (30 к/с).

После обесцвечивания флуоресцентных красителей при помощи мощного воздействия лазерного излучения на изучаемую области, наблюдают процесс восстановления флуоресценции во времени для анализа скорости диффузии молекул. Гибридный сканер А1R+ позволяет фиксировать восстановление флуоресценции во время обесцвечивания в изучаемой области.

До фотообесцвечивания

Сразу после обесцвечивания

Через 2 секунды после обесцвечивания

Клетка HeLa, экспрессирующая CREB-GFP, обесцвечивается во время наблюдения FRAP. Изучаемая область фотообесцвечивается лазером с длиной волны 408 нм, во время параллельной фиксации изображений с помощью лазера с длиной волны 488 нм и скоростью 30 к/с при комнатной температуре.

FRET – это физическое явление, наблюдаемое, когда две флуоресцентные молекулы сближаются на расстояние порядка 10 нм. Когда спектры испускания и поглощения флуоресцентных молекул перекрываются и ориентации электрических диполей молекул совпадают, может произойти безызлучательный перенос энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору.

Клетки HeLa, экспрессирующие Yellow Chameleon 3.60, были возбуждены лазером 457 нм. После стимуляции гистамином наблюдалась динамика концентрации ионов кальция. Эмиссия CFP (синяя) и эмиссия YFP (желтая) показаны как зеленый и красный каналы соответственно. Одновременно с увеличением концентрации ионов кальция в клетке, эффективность переноса энергии между CFP и YFP возрастает, интенсивность флуоресценции CFP уменьшается, а интенсивность флуоресценции YFP увеличивается. Длина волны активирующего лазера: 457 нм, размер изображения 512 х 512 пикселей, 30 к/с (при помощи резонансного сканера).

Содержащиеся в клетке составы – это биологически активные молекулы, которые были приведены в состояние функционально инертных, и могут быть мгновенно реактивированы при помощи ближнего ультрафиолетового излучения. За счет контроля световой экспозиции можно осуществлять активную молекулярную экспрессию в заранее заданных межмолекулярных центрах c высоким пространственным и временным разрешением.

Изображение клетки почки человеческого эмбриона (HEK), содержащей кальций и Fluo-4, фиксируется при помощи лазера с длиной волны 488 нм и со скоростью 120 к/с, красная область изучения высвобождается при помощи лазера с длиной волны 408 нм.

Временное повышение концентрации межклеточного кальция (Ca2+), вызванного рецептором рианодина (RyRs), называется кальциевой искрой.

Ca2+ высвобождается из саркоплазматического ретикулума (SR) в клетку благодаря механизму кальцийиндуцированного высвобождения кальция (CICR). Кальциевые искры наблюдаются в локальных микроскопических регионах в течение крайне небольшого промежутка времени.

Изображение кальциевых искр в изолированном кардиомиоците мыши, содержащий индикатор кальция, получено со скоростью 230 к/с (4 мс/кадр, при помощи резонансного сканера).

Dronpa-green – это фотохромный флуоресцентный белок, который теряет флуоресценцию после воздействия на него сине-зеленого излучения (488 нм), а его абсорбционный спектр сдвигается в область 405 нм. Когда его снова облучают фиолетовым светом (405 нм), он восстанавливает флуоресцирующие свойства.

В точке фотообесцвечивания, желтая область изучения – вся LLC-PK1 клетка, стабильно экспрессирующая Dronpa-green – была экспонирована излучением 488 нм для деактивации ее флуоресцентных свойств, а в точке фотоактивации (красная область изучения) – часть ядра – была экспонирована излучением 408 нм для активации флуоресценции. Возбуждение слабым светом с длиной волны 488 нм позволяет наблюдать за динамикой молекул, излучающих зеленую флуоресценцию.

Одновременные процессы фотоактивации и получения флуоресцентного изображения производятся при помощи резонансного и гальванического сканеров. Получение изображений быстрых биологических процессов после фотоактивации возможно благодаря тому, что резонансный сканер способен получать изображения со скоростью 30 к/с.

Изображения получены с частотой кадров, аналогичной видеоформату (30 к/с) во время фотоактивации лазером 405 нм.

Получение одновременно ярких и четких и изображений стало возможным благодаря технологическому усовершенствованию блока точечной диафрагмы.

Блок точечной диафрагмы VAAS изменяет существующую концепцию конфокального микроскопа.

Общепринятым фактом считается то, что уменьшение размера точечной диафрагмы для устранения света от нефокальной плоскости является причиной более темных изображений. VAAS (система виртуальной адаптируемой диафрагмы) представляет собой новейшую разработку в области конфокальной микроскопии, которая ликвидирует блики с сохранением яркости изображений.

1. Возможно получение более ярких изображений без бликов.

2. За счет деконволюции возможно моделирование различных срезов (разной толщины) после получения изображения.

3. Изображения как в фокальной плоскости, так и лежащее вне этой плоскости, могут быть получены за одно сканирование, что увеличивает скорость работы и уменьшает повреждение живых клеток.

Обычный конфокальный микроскоп

Малые точечные диафрагмы уменьшают количество бликов, но затемняют изображение, в то время как большая точечная диафрагма увеличивает яркость изображения, но при этом увеличивает и количество бликов.

Красным показан сигнал из фокальной плоскости.

При помощи деконволюции света, проходящего через точечную диафрагму, и света, не проходящего через нее, при использовании большой диафрагмы блики могут быть устранены.

Красным показан сигнал из фокальной плоскости. Зеленым - сигнал из области, находящейся вне фокальной плоскости.

На графике зеленым показан сигнал с конфокального микроскопа, красным – с технологией VAAS. Видно, что изображения VAAS содержат меньше фонового шума.

При снятии изображения смеси из 10-мкм и 0,1 мкм флуоресцирующих шариков в обычном конфокальном микроскопе флуоресценция 10-мкм шариков теряется при использовании больших точечных отверстий. Блок системы VAAS создает изображение без потерь в области, находящейся вне фокуса.

Обычное конфокальное
изображение

Изображение, полученное
с помощью системы VAAS

Конфокальное изображение

Дифференцированное
изображение VAAS

Спектральные характеристики микроскопов Nikon улучшены в конфокальных микроскопах серии А1+ и позволяют в высокоскоростном режиме получать спектральные изображения в процессе одного сканирования. Помимо этого, используются новые функции, в том числе V-фильтрация.

Разрешение по длинам волн может изменяться с помощью трех разных дифракционных решеток (2,5/6/10 нм). Каждое положение точно контролируется для достижения максимальной воспроизводимости длины волны.

Используется точно скорректированный 32-х канальный линейный детектор. Подвижный механизм тройного экранирования позволяет использовать до четырех лазеров одновременно.

При помощи системы DEES, неполяризованный флуоресцентный свет, излучаемый образцом, разделяется при помощи делителя поляризованных лучей на два поляризованных световых луча P и S. Затем, луч с P-поляризацией преобразуется при помощи устройства поворота плоскости поляризации в S-поляризованный луч, так как S луч обладает большей эффективностью дифракции, чем Р и достигается значительное увеличение общей эффективности.

Концы флуоресцентных световодов и поверхности детектора покрыты специальным противоотражающим покрытием, чтобы свести все потери сигнала к минимуму, чем достигается высокая степень оптического пропускания.

Три метода коррекции позволяют получить точный спектр: межканальная коррекция чувствительности, которая регулирует смещение и чувствительность каждого канала; коррекция спектральной чувствительности, которая регулирует спектральную эффективность дифракционной решетки и эффективность спектрального детектора; коррекция спектрального пропускания в оптических элементах сканирующих головок и микроскопов.

Уникальная технология обработки сигнала и высокоскоростная система перевода аналогового сигнала в цифровой позволяют получать 32-х канальные спектральные изображения (512 x 512 пикселей) за 0,6 сек. Кроме того, достигается скорость получения изображений с разрешением 512 x 32 пикселей, равная 24-м кадрам в секунду.

Клетки HeLa с ДНК и РНК, окрашенные при помощи Acridine Orange. Спектральные изображения в диапазоне длин волн 500-692 нм при возбуждении лазером 488 нм с разрешением 6 нм.

Точное спектральное разделение обеспечивает максимальную производительность в разделении взаимоперекрывающихся спектров флуоресценции и устранение автофлуоресценции.

Разделенные изображения клеток HeLa с флуоресцентными метками пяти цветов:

Ядро (DAPI)

Виникулин (Alexa488)

Виментин (Alexa568)

Тубулин (Alexa594)

Актин (Phalloidin-Alexa633)

Новейшие алгоритмы, а также высокоскоростная обработка данных позволяют разделять спектральные изображения в режиме реального времени, во время захвата изображения, в то время как раньше это осуществлялось после окончания процесса формирования спектрального изображения. Это особенно эффективно для FRET анализа, с тех пор как зонды с близкими спектрами, такие как CFP и YFP, GFP и YFP, которые раньше было трудно разделить, можно разделять в режиме реального времени.

Три определяемых пользователем экрана для защиты детекторов от прямого лазерного излучения позволяют одновременно использовать четыре лазера, выбранных из максимального количества длин волн (9), что, в свою очередь, позволяет расширить границы спектрального анализа.

Желаемые спектральные диапазоны, совпадающие со спектром используемого флуоресцентного красителя, могут быть выбраны из 32 каналов и скомбинированы для выполнения функций фильтрации. При определении наиболее подходящего диапазона длин волн, становится возможным получение изображения с оптимальным уровнем интенсивности излучения каждого красителя при реакции FRET и колокализации. Одновременно может быть выбрано до четырех диапазонов длин волн. Чувствительность в каждом диапазоне можно регулировать отдельно, что дает возможность использовать разные комбинации красителей.