Мультифотонный конфокальный микроскоп Nikon A1 MP+, A1R MP+

A1 MP+ оборудован гальвано- (нерезонансным) сканером для получения изображений высокого разрешения.

Гальванический (нерезонансный) сканер A1 MP+ обеспечивает получение изображений с высоким разрешением (до 4096 х 4096 пикселей). Помимо этого, благодаря новейшим системам привода сканера и отбора образцов, а также уникальной технологии коррекции изображений Nikon, также возможно высокоскоростное получение изображений со скоростью 10 к/с (512 х 512 пикселей).

1D сканирование: 5200 строк в секунду
2D сканирование: 130 к/с (512 х 32 пикселя)
Полнокадровое сканирование: 10 к/с (512 х 512 пикселей)

Стандартный четырехканальный детектор избавляет от необходимости приобретения дополнительного флуоресцентного детектора и позволяет с легкостью получать изображения образца, помеченного четырьмя зондами.

Серия Z-проекций XYZ изображений клетки LLC-PK1, экспреcсирующей EGFP-альфа-тубулин (зеленый) и Histone H2B-mCherry (красный). Изображение фиксировалось каждые 2 минуты с помощью гальванического сканера.

Белок Kaede необратимо изменяет цвет флуоресценции с зеленого на красный из-за спектральной конверсии при воздействии на него излучения от ультрафиолетовой до фиолетовой области спектра.

В момент фиксации изображения клетки HeLa, экспрессирующей Kaede с зеленой и красной флуоресценцией, при помощи лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм, в качестве возбуждающих, для фото-конверсии белок Kaede в изучаемой области непрерывно активировался лазером с длиной волны 405 нм. На фотографиях представлена дисперсия красной флуоресценции Kaede, вызываемой фото-конверсией.

Длина волны активирующего лазера: 405 нм, длина волны лазера, фиксирующего изображение: 488 нм / 561 нм, размер изображения 512 х 512 пикселей, скорость захвата 1 к/с (при помощи гальванического сканера).

Фотоактивируемый белок Phamret - это гибридный белок состоящий из двух частей: белка CFP и белка PA-GFP. Когда белок PA-GFP активируются при помощи фиолетово-ультрафиолетового излучения, его светло-голубая флуоресценция в результате межмолекулярного резонансного переноса энергии от CFP к PA-GFP изменяется на зеленую.

Во время получения изображения клеток HeLa, экспрессирующих Phamret посредством голубой и зеленой флуоресценции, при помощи лазера с длиной волны 457 нм, часть PA-GFP в изучаемой области непрерывно возбуждается лазером с длиной волны 405 нм. Активированная часть, наблюдаемая в области голубой флуоресценции (показана на изображении оттенками серого) испускает зеленую флуоресценцию (на изображениях показана красным). Реакция, на которую указывает зеленое свечение, является реакцией дисперсии Phamret (на изображениях она показана красным).

Комбинированная сканирующая головка A1R MP+ снабжена и гальвано-сканером, и резонансным сканером со сверхвысокой резонансной частотой равной 7,8 кГц.

Гальванический (нерезонансный) сканер A1R MP+ обеспечивает получение изображений с высоким разрешением (до 4096 х 4096 пикселей).
Резонансный сканер обеспечивает получение изображений и фотоактивацию со скоростью 420 кадров/сек (512 х 32 пикселей), которая необходима для выявления клеточной динамики и взаимодействия.

1D Сканирование: 15 600 строк в секунду (с/с)
2D Сканирование: 420 к/с (512 х 32 пикселя)
Полнокадровое сканирование: 30 к/с (512 х 512 пикселей)

Резонансный сканер (зеленый оптический путь) используется для получения изображений с высокой скоростью до 420 к/с (с разрешением 512 х 512 пикселей). Во время одновременной фотоактивации и получения изображений резонансный сканер используется для регистрации изображений.

Гальванический сканер (синий оптический путь) используется для получения высококачественных изображений с высоким разрешением до 4096 х 4096 пикселей. Также возможно высокоскоростное получение изображений с частотой кадров до 10 к/с (с разрешением 512 х 512 пикселей). Во время одновременной фотоактивации и получения изображений гальванический сканер используется для фотостимуляции.

Гибридный сканер - это механизм, который позволяет гибко переключаться между двумя сканерами (резонансный и гальванический), либо использовать их одновременно с помощью высокоскоростного гипер-селектора.
Может быть введено излучение одновременно от 7 лазеров (максимум 9 длин волн).

Одновременные процессы фотоактивации и получения флуоресцентных изображений проводятся при помощи гальвано-сканера и резонансного сканера. Получение изображений быстрых биологических процессов после фотоактивации возможно благодаря тому, что резонансный сканер способен получать изображения со скоростью 30 кадров/сек.

Для высокоскоростного получения изображения с помощью резонансного сканера используется оригинальная методика определения положения сканирующего зеркала компании Nikon. Постоянные тактовые импульсы генерируются оптическим способом, что обеспечивает отсутствие как эффекта мерцания, так и искажений даже на самой высокой скорости сканирования.

Волоконно-оптическая система передачи данных может транслировать данные с максимальной скоростью 4 Гбит в секунду. Это позволяет передавать изображения (512 х 512 пикселей, 16 бит) в пяти режимах со скоростью 30 кадров в секунду.

Резонансные сканеры не страдают от перегрева мотора при высокоскоростном получении изображений. Таким образом, отсутствует необходимость в сокращении поля обзора сканированного изображения для предотвращения перегрева. Это обеспечивает большее поле обзора, чем у гальванического сканера.

В случае мультифотонного возбуждения флуоресцентные излучения из глубоких тканей образца сильно рассеиваются, поэтому традиционный детектор, использующий точечную диафрагму, не может обеспечить получение ярких флуоресцентных изображений. Эпископический NDD детектор в A1 MP+/A1R MP+ расположен близко к задней апертуре объектива, что обеспечивает более эффективную регистрацию рассеянного сигнала от глубоких слоев тканей живых организмов. Использование этого четырехканального детектора в сочетании со специальными спектральными зеркалами и алгоритмом спектрального разделения компании Nikon исключает наложение спектров флуоресцентных зондов. При этом исключается фоновая автофлуоресценция, что обеспечивает получение высококонтрастного изображения глубоких слоев образца. При использовании диаскопического NDD детектора вместе с эпископическим NDD детектором можно получить более яркие изображения, благодаря регистрации как отраженных, так и прямых флуоресцентных сигналов.

Кора головного мозга линии Н мыши в возрасте 5 недель была изучена методом открытого черепа. Вся форма дендрита пирамидальной клетки в слое V экспрессирующая EYEP была визуализирована от нижнего до поверхностного слоя. Кроме того, был также изучен флуоресцентный сигнал от белого вещества в более глубоких зонах.

Слева направо:
1. Дендриты, расположенные в поверхностных слоях пирамидальных клеток слоя V на глубине 25 мкм
2. Базальные дендриты в пирамидальных клетках слоя V на глубине 625 мкм
3. Флуоресцентное излучение от белого вещества

Длина волны возбуждения: 930 нм
Объектив: CFI75 Апохромат 25хW MP (числовая апертура -1,10, рабочее расстояние - 2,0)

Одновременное получение по трем каналам изображений коры головного мозга мыши при анестезии с использованием YFP-H при ИК излучением с длиной волны 950 нм и получение изображений генерации второй гармоники (SHG) и двух флуоресцентных излучений.

Голубой: SHG сигнал от твердой оболочки мозга
Желтый: EYFP пирамидальные нейроны в слое V коры головного мозга
Красный: Кровеносные сосуды меченные SRB

При мультифотонном возбуждении флуорофоры имеют значительно более широкий профиль спектра поглощения по сравнению с однофотонным возбуждением. Поэтому возможно одновременное возбуждение нескольких флуорофоров при помощи одной длины волны возбуждения.

Кроме того, можно изменять длину волны импульсного лазера для мультифотонного возбуждения и пользователь может выбрать подходящую длину волны для возбуждения нескольких флуорофоров.

Детектор A1 MP+/A1R MP+ NDD и технология разделения каналов позволяют пользователю четко разграничивать флуорофоры и получать информацию о структуре глубоких слоев живого образца.

Одновременное получение трехцветных изображений мыши под анестезией при помощи YFP-H при возбуждении ИК излучением с длиной волны 950 нм.
Изображение получено при помощи функции разделения. Видно, что кровеносные сосуды и нейроны четко разделены.

Зачаток спинного мозга (нервная трубка) эмбриона крысы в возрасте 12,5 дней.
Эмбрион выращивали приблизительно 44 часа после трансфекции левых и правых нервных клеток eGFP и YFP путем электропорации.
Поперечный срез спинного мозга был помещен в гель и одновременное возбуждение eGFP и YFP при помощи импульсного ИК лазера (930 нм).
Изображение получено при помощи NDD детектора и была применена функция разделения.
Было получено четкое изображение промежуточного нейрона и комиссурального аксона.

Новый GaAsP NDD детектор позволяет получать in vivo четкие изображения более глубоких слоев ткани образцов чем прежде и представляет собой достаточно мощное устройство для анализа, например, нейронов мозга живых организмов.

Чувствительность недавно разработанного GaAsP NDD детектора почти в 2 раза превосходит чувствительность стандартного NDD детектора. Это обеспечивает более быстрое формирование изображений и формирование более качественных изображений из Z-стэков. Высокая чувствительность детектора обеспечивает получение флуоресцентных сигналов при меньшей мощности лазера, что позволяет уменьшить наносимый живым клеткам вред.

Получение изображений мозга живой мыши (в возрасте 4 недели) под анестезией с использованием YFP-H методом открытого черепа.
Визуализация всех пирамидальных нейронов слоя V и более глубоких гиппокампальных нейронов. Глубокое изображение достигается для 3-ех мерного изображения гиппокампальных дендритов расположенных на глубине более 1,1 мм.

Также доступна модель NDD детектора на GaAsP для использования с лазером 1300 нм для получения изображений на глубине до 1,4 мм.

Резонансный сканер Nikon способен получать изображения на достаточно высокой скорости (420 кадров/сек) и является самым быстрым мультифотонным микроскопом в мире, использующим технологию точечного сканирования. Уникальным элементом в этом устройстве является зеркало резонансного сканера, способное регистрировать изображения на значительно более высокой скорости по сравнению с традиционными гальванометрическими сканерами. Оптическая система контроля положение резонансного зеркала в режиме реального времени регулирует частоту пикселизации и позволяет получать более стабильные, геометрически правильные и равномерно освещенные изображения даже на высоких скоростях. Это обеспечивает успешную визуализацию быстрых изменений в живых организмах, например, реакции живых организмов, динамику и взаимодействия клеток.

Клетки крови в кровеносных сосудах живого организма были возбуждены фемтосекундным импульсным ИК лазером со сверхскоростным резонансным сканером A1R MP+. Их перемещения были зарегистрированы в форме трех последовательных флуоресцентных изображений на скорости 30 кадров/сек (30 мсек) в трех отдельных цветовых каналах.
Были возбуждены и зарегистрированы три флуоресцентных зонда – ядро (синий), эндотелий (зеленый) и плазма (красный). Длинноволновый сверхбыстрый лазер в сочетании со сверхскоростным резонансным сканером эффективно снижает фотоповреждение и предоставляет возможность получения мультифотонных изображений биомолекул с временным разрешением.

Кора головного мозга мыши (возраст 4 недели) была изучена методом открытого черепа под анестезией с использованием YFP-H. В хвостовую вену был введен SRB (сульфородамин-В). Используя резонансное сканирование при помощи эпископического детектора GaAsP NDD можно получить изображения тока крови в различных положениях Z.
Желтый: пирамидальные клетки EYFP в слое V коры головного мозга

Конфокальный микроскоп A1 MP+ компании Nikon позволяет получать спектральные изображения на высоких скоростях за одно сканирование. Кроме того, предусмотрены расширенные функции, включая спектральное разделение в режиме реального времени.

Разрешение по длинам волн может изменяться с помощью трех разных дифракционных решеток (2,5/6/10 нм). Каждое положение точно контролируется для достижения максимальной воспроизводимости длины волны.

Используется точно скорректированный 32-х канальный линейный детектор. Подвижный механизм тройного экранирования позволяет использовать до четырех лазеров одновременно.

При помощи системы DEES, неполяризованный флуоресцентный свет, излучаемый образцом, разделяется при помощи делителя поляризованных лучей на два поляризованных световых луча P и S. Затем, луч с P-поляризацией преобразуется при помощи устройства поворота плоскости поляризации в S-поляризованный луч, так как S луч обладает большей эффективностью дифракции, чем Р и достигается значительное увеличение общей эффективности.

Концы флуоресцентных световодов и поверхности детектора покрыты специальным противоотражающим покрытием, чтобы свести все потери сигнала к минимуму, чем достигается высокая степень оптического пропускания.

Три метода коррекции позволяют получить точный спектр: межканальная коррекция чувствительности, которая регулирует смещение и чувствительность каждого канала; коррекция спектральной чувствительности, которая регулирует спектральную эффективность дифракционной решетки и эффективность спектрального детектора; коррекция спектрального пропускания в оптических элементах сканирующих головок и микроскопов.