Конфокальный микроскоп Nikon C2+, C2si+

В дополнение к обычному трехканальному флуоресцентному детектору, конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Nikon C2si+ оборудован специальным спектральным детектором для формирования спектральных изображений. Переключая детекторы, можно получить точные спектральные данные флуоресцентных сигналов. Nikon C2si+ фиксирует малые изменения длины волны в спектре, а также разделяет наложенные спектры. Более того, существует возможность за одно сканирование получить спектр в диапазоне более 320 нм, минимизируя при этом наносимый живым клеткам вред.

Разрешение по длинам волн не зависит от диаметра диафрагмы

В спектральном детекторе предусмотрен экранирующий механизм для лазера. В сочетании с разрешением длины волны, которое не зависит от диаметра диафрагмы, этот механизм успешно перекрывает отраженный лазерный луч. Блокировочный механизм можно легко перемещать при помощи программного обеспечения, позволяя пользователям блокировать любую длину волн лазера и делая C2si+ совместимым с любым лазером.

Разрешение по длинам волн может изменяться с помощью трех разных решеток (2,5/6/10 нм). Каждое положение точно контролируется для достижения максимальной воспроизводимости длины волны.

Высокая эффективность дифракции достигается путем согласования направления поляризации падающего на решетку света с S-плоскостью поляризации. При помощи системы улучшения дифракционной эффективности (DEES) неполяризованный флуоресцентный свет, излучаемый образцом, разделяется при помощи делителя поляризованных лучей на два поляризованных световых луча P и S. Затем, луч P-поляризацией преобразуется с помощью устройства поворота плоскости поляризации в S-поляризованный луч, так как S луч обладает большей эффективностью дифракции чем Р, достигается значительное увеличение общей дифракции.

Концы флуоресцентных световодов и поверхности детектора покрыты специальным противоотражающим покрытием, чтобы свести все потери сигнала к минимуму, чем достигается высокая степень оптического пропускания.

Три метода коррекции позволяют получить точный спектр: межканальная коррекция чувствительности, которая регулирует смещение и чувствительность каждого канала; коррекция спектральной чувствительности, которая регулирует спектральную эффективность дифракционной решетки и эффективность спектрального детектора; коррекция спектрального пропускания в оптических элементах сканирующих головок и микроскопах.

Флуоресцентные метки с перекрывающимися спектрами можно разделить без взаимных помех. Даже без эталонного спектра можно разделить флуоресцентные спектры, для этого необходимо выделить изучаемую область и нажать кнопку Simple Unmixing (Простое разделение). В C2si+ имеется встроенная база спектральных данных, предоставленная производителями флуоресцентных красителей, которые могут быть определены как эталонный спектр для флуоресцентного разделения. Пользователи могут также добавить в базу данных спектральную информацию для новых меток.

Благодаря возможности выбора разрешения и диапазона, за один раз можно просканировать такой флуоресцентный белок как CFP/GFP/YFP/Ds Red в широком диапазоне длин волны от синей до красной области спектра. Справочные данные позволяют разделять и отображать белок любого цвета.

Красные флуорохромы, работа с которыми ранее являлась сложной задачей, сейчас легко разделить.

Спектры для изучаемых областей 1 и 2 в соответствии с изображениями справа. Пик спектра флуоресценции родамина находится приблизительно в области 579 нм, в то время как такой пик для RFP – приблизительно в области 600 нм. Флуоресцентное излучение RFP слабее, чем излучение родамина, но их спектры можно четко разделить.

Разделение флуоресцентного излучения позволяет не только разделять перекрывающиеся флуоресцентные спектры, например CFP и YFP, но также удалять автофлуоресценцию клеток, что ранее было сложно выполнить.

Во время конфокального наблюдения флуоресцентное излучение визуализируется как интенсивность флуоресцентного излучения в определенном диапазоне длин волны. Спектральный детектор позволяет подтвердить подробные спектральные характеристики флуоресцентного излучения.

Анализ резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) с использованием спектрального изображения позволяет проводить трехмерный анализ с высоким отношением сигнал/шум и высокой разрешающей способностью, а также как легко определить FRET путем определения спектральных измерений, полученных в результате FRET в режиме реального времени.

При наложении спектров донора и акцептора подобно CFP и YFP, разделение с использованием справочных данных позволяет обнаружить детальные изменения интенсивности и проанализировать соотношение флуоресцентных сигналов (YFP/CFP).

При наложении спектров донора и акцептора подобно CFP и YFP, разделение с использованием справочных данных позволяет обнаружить детальные изменения интенсивности и проанализировать соотношение флуоресцентных сигналов (YFP/CFP).

Спектральное изображение в диапазоне 460-620 нм, полученное при разрешении 5 нм с использованием спектрального детектора, позволяет наблюдать за изменениями длины волны флуоресцентного излучения.

Перед АТФ стимуляцией

8 секунд после АТФ стимуляции

Изображение в естественных цветах и спектральный анализ CFP и YFP. Левый пик указывает на CFP, а правый на YFP соответственно. После АТФ стимуляции наблюдается снижение пика CFP и увеличение пика YFP из-за FRET.

Спектральный анализ FRET возможен путем разделения с использованием справочных данных CFP и YFP. Двухмерное изменение (FRET) внутриклеточной концентрации Ca2+ легко определить по спектральным данным (без обесцвечивания акцептора).

Изображение FRET после спектрального разделения. CFP обозначается синим, а YPF – зеленым.

Изменения за промежуток времени (T) и спектры можно анализировать в трехмерном пространстве (XYZ).

Перед АТФ стимуляцией

8 секунд после АТФ стимуляции