Микроскоп сверхвысокого разрешения Nikon N-SIM

Система N-SIM существенно повышает возможность решения задач в области наноскопии и придает уверенность в правильности выводов, которые можно сделать на основе полученных данных.

Новый микроскоп сверхвысокого разрешения Nikon N-SIM дает возможность исследовать структуру и функции живых клеток на наноуровне.

Разрешение традиционных оптических микроскопов, даже оснащенных объективами с высокой числовой апертурой, ограничено дифракцией и составляет не более 200 нм.

Используя высокочастотное структурированное освещение, микроскоп Nikon N-SIM может обеспечить разрешение до 85 нм (при возбуждении лазером 488 нм, в режиме TIRF-SIM), что ранее считалось невозможным для оптических микроскопов. Кроме того, при временной разрешающей способности до 0,6 сек/кадр (в режиме 2D-SIM/TIRF-SIM), микроскоп N-SIM обеспечивает съемку со сверхвысоким разрешением динамических процессов молекулярного взаимодействия в живых клетках.

Традиционный световой микроскоп

Микроскоп N-SIM (режим 3D-SIM)

Микротрубочки в клетке меланомы B16, меченные YFP
Объектив: CFI Apo TIRF 100x oil (NA 1,49). Скорость захвата изображения: около 1,8 сек/кадр

В микроскопии структурированного освещения неизвестная клеточная наноструктура изучается путем анализа муарового рисунка, появляющегося при освещении образца высокочастотным структурированным излучением.

Сочетая технологию структурированного освещения с использованием высокоапертурного объектива Nikon CFI Apo TIRF 100x oil (числовая апертура 1,49), микроскоп N-SIM обеспечивает пространственное разрешение почти в два раза превышающее разрешение обычных оптических микроскопов (до приблизительно 85 нм при возбуждении лазером 488 нм, в режиме TIRF-SIM) и позволяет получить наглядное представление о мельчайших межклеточных структурах и их взаимодействии.

Микроскоп N-SIM также обеспечивает сверхбыстрое получение изображений. Временное разрешение составляет до 0,6 сек/кадр, что позволяет получать изображения живых клеток (в режиме TIRF-SIM/2D-SIM; получение изображений с временным разрешением до приблизительно 1 сек/кадр возможно в режиме 3D-SIM).

Традиционный световой микроскоп

Микроскоп N-SIM (режим 3D-SIM)

Эндоплазматический ретикулум (ЭР) в живой клетке HeLa, меченной GFP
Объектив: CFI Apo TIRF 100x oil (NA 1,49). Скорость захвата изображения: около 1,5 сек/кадр

Этот режим обеспечивает получение двумерных изображений сверхвысокого разрешения на высокой скорости и с невероятно высокой контрастностью. Режим TIRF-SIM использует преимущества наблюдения при флуоресценции полного внутреннего отражения с разрешением, в два раза превышающим разрешение обычных микроскопов TIRF, что позволяет лучше понять взаимодействие молекул на поверхности клетки.

Наблюдение с использованием микроскопа N-SIM при сверхвысоким аксиальном разрешении обеспечивает получение оптического среза образцов при разрешении 300 нм в клетках и тканях толщиной до 20 ?м. Кроме того, в режиме 3D SIM устраняется фоновая флуоресценция, что позволяет получить высококонтрастное изображение.

Возможна комбинация с системой N-STORM на одном инвертированном микроскопе Ti.

Модуль Nikon LU-5 - это система, предусматривающая установку до 5 различных лазеров, обеспечивающая естественное многоцветное изображение со сверхвысоким разрешением. Реальная цветопередача является существенной при исследовании динамического взаимодействия различных белков на молекулярном уровне.

Доступны лазерные модули LU-NV.

Обычный TIRF

Режим TIRF-SIM

Цитоплазматическая мембрана клетки меланомы В16, меченая желтым флуоресцентным белком
Объектив: CFI Apo TIRF 100x oil (NА 1,49)

Аналитическая обработка записанных муаровых изображений с помощью математических методов позволяет восстановить структуру образца со сверхвысоким разрешением.

Использование лазерной интерференции высоких пространственных частот для освещения структуры внутри образца дает муаровые интерференционные полосы, которые фиксируются. Эти муаровые интерференционные полосы включают модулированную информацию о структуре образца с более высоким разрешением.

В процессе обработки изображения эта информация восстанавливается, что позволяет достичь разрешения, превышающего разрешение обычных оптических микроскопов.

Муаровые изображения содержат информацию о мельчайших структурах внутри образца. Фиксируются многочисленные фазы и ориентации структурированного освещения, а информация "сверхвысокого разрешения" извлекается из муаровых интерференционных полос. Эта информация комбинируется математически в "Фурье-пространстве" или апертурном пространстве, затем трансформируется обратно в пространство изображения, что позволяет получить изображение с разрешением, в два раза превышающим обычный предел.

Извлечение информации о структуре образца осуществляется путем анализа изображений в трех ориентациях, что позволяет в результате математической обработки создать изображения сверхвысокого разрешения.

Захват информации высокого разрешения, высокой пространственной частоты ограничен числовой апертурой (NА) объективов, и пространственные частоты структуры за пределами апертуры оптической системы не фиксируются.

Освещение образца высокочастотным структурированным излучением позволяет получить изображение со сверхвысоким разрешением в пределах апертуры оптической системы.

Когда эта информация о "сверхвысоком разрешении" математически комбинируется со стандартной информацией, полученной посредством линз объектива, результатом становится удвоение значения NA и, соответственно, разрешения оптической системы.

На рисунках показаны изображения флуоресцирующих точек диаметром 100 нм, зафиксированные обычным микроскопом и микроскопом сверхвысокого разрешения N-SIM. Профили интенсивности точечных изображений указывают, что разрешающая сила микроскопа сверхвысокого разрешения почти в два раза превышает разрешающую силу обычного флуоресцентного микроскопа.

Обычный флуоресцентный микроскоп

TIRF-SIM